1、各組之間的差異代謝物

對指甲樣本進行非靶向GC-MS分析，鑒定出126種代謝物。其中，30種代謝物在五個CDR組（CDR=0、0.5、1、2和3）中存在差異表達，它們在認知能力下降的整個過程中呈現(xiàn)出顯著趨勢。在這些DEM中，十二烷酸從認知正常組（CDR=0）到晚期AD（CDR=3）呈現(xiàn)出尤為明顯的下降趨勢。對已鑒定的30種DEM進行聚類分析，得出8個不同的簇。如圖2C所示，包含十二烷酸的簇4在所有CDR組中均呈現(xiàn)出顯著的單調表達下降。

2、有序邏輯回歸和淀粉樣蛋白亞組分析

為了評估十二烷酸與疾病嚴重程度之間的獨立性關聯(lián)，對十二烷酸采用了有序邏輯回歸模型。結果表明，在調整年齡、性別、教育、BMI、生活方式因素、營養(yǎng)和睡眠質量后，較低的十二烷酸與較高的CDR評分仍然顯著相關。為了確定觀察到的代謝物變化是否由淀粉樣蛋白病理學驅動，作者進一步根據(jù)淀粉樣蛋白PET結果進行了亞組分析。在每個CDR類別（0.5、1、2、3）中，比較了淀粉樣蛋白陽性個體和未掃描個體的指甲十二烷酸水平。發(fā)現(xiàn)，在CDR=0.5、1、2和3的水平下，未觀察到顯著差異，這進一步證實了指甲代謝物反映的是疾病的嚴重程度，而不僅僅是淀粉樣蛋白的病理。

3、通路富集及其與臨床指標的相關性

作者在多組比較中總共鑒定出32個獨特的DEM。還進行了KEGG富集分析。結果發(fā)現(xiàn)十二烷酸在脂肪酸生物合成途徑中起著重要作用，這表明脂肪酸代謝紊亂在AD病理生理學中起著關鍵作用。相關性分析顯示，十二烷酸與AVLT-IR呈正相關（r?=0.29），與ADAS-Cog呈負相關（r?=?0.32）。這些關系表明，十二烷酸水平較低時，記憶力較差，認知障礙更明顯。

4、機器學習模型性能

為了評估這些代謝物的診斷潛力，作者在29個DEM上訓練了多個機器學習模型，其中深度學習算法在多類分類中取得了最高的性能，在獨立測試集上實現(xiàn)了67.24%的總體準確率。識別CDR=0、CDR=0.5和CDR≥1的精度分別為80.0%、60.0%和69.7%（表2）。此外，該模型表現(xiàn)出很強的判別能力，microAUC為80.34%，macroAUC為76.52%。各組的單因素與靜息AUC值均超過70.0%，最高可達86.85%，支持了這些代謝生物標志物的穩(wěn)健性。變量重要性分析顯示，十二烷酸為最大貢獻者，其次是蘋果酸1、膽甾-3,5-二烯和甲基13-甲基十四烷酸。這些代謝物隨著CDR評分的增加呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，進一步支持了它們作為AD診斷和監(jiān)測候選生物標志物的潛力。